توکسو پلاسما گوندی دارای آنتی ژنهای ایمنوژنیک متعددی است. مهمترین آنتی ژنهای توکسوپلاسما آنتی ژنهای سوماتیک و دفعی- ترشحی می باشند. پروتئین های راپتری به عنوان آنتی ژن دفعی- ترشحی شناخته می شوند. این آنتی ژنها برای ساخت واکسن بر علیه توکسوپلاسموزیس کاندیدا هستند. هدف اصلی این مطالعه کلون گردن ژن ROP1 توکسو پلاسما گوندی (RH) در وکتور کلونینگ مناسب به منظور آنالیز ژن و استفاده از آن برای مطالعات بعدی تولید پروتئین بود.تاکی زوئیت های سویه RH توکسوپلاسما گوندی از مایع صفاقی موشهای آلوده به انگل جمع آوری شد. DNA ژنومی به روش فنل- کلروفرم استخراج گردید. قطعه ROP1 با پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. محصول PCR خالص شده بین سایتهای EcoR1 و BamH1 وکتور pTZ57R/T قرار گرفت و در سویه TG1 اشریشیاکلی ترانسفرم گردید و توسط IPTG و X-Gal غربالگری شد. پلاسمید طراحی شده استخراج گردید و بعد از الکتروفورز با اشعه UV مشاهده گردید. قطعه تکثیر شده با موفقیت در وکتور pTZ57R/T کلون شد. صحیح قرارگرفتن قطعه ROP1 در پلاسمید طراحی شده توسط آنزیم های برش دهنده و sequencing بررسی گردید. بعد از برش، قطعه ای حدود 760 bp از پلاسمید جداشد که بعد از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز مشاهده گردید. توالی ژن تکثیر یافته نشان دهنده هومولوژی بیش از %96 با ژن مورد نظر در GenBank بود.

مقدمه: توکسوپلاسماگوندی یک تک یاخته داخل سلولی می باشد که باعث بیماری توکسوپلاسموزیس در انسان و حیوانات می شود. بیمارانی که نقص سیستم ایمنی دارند، عفونت مزمن این بیماری می تواند دوباره فعال شده و باعث آنسفالیت شود که اغلب کشنده می باشد. پروتئین راپتری 2 توکسوپلاسماگوندی (ROP2) یکی از میانجی های مهم در آمیزش ارگانل PVM - می باشد. پروتئین ROP2 در بدن انسان توسط کلون Tcell شناسایی می شود. همچنین ROP2 برای Bcell دارای اپی توپ می باشد. همه این ویژگی های ROP2 باعث شده که از این پروتئین به عنوان کاندید برای تهیه واکسن های نوترکیبی و کوکتلی علیه توکسوپلاسموزیس استفاده شود.مواد و روش ها: در این مقاله کلونینگ و توالی یابی ژن کدکننده پروتئین کامل ROP2 از توکسوپلاسما گوندی توصیف خواهد شد. در این تحقیق، ابتدا DNA ژنومی توکسوپلاسماگوندی استخراج شده و از آن برای تکثیر ژن کامل ROP2 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی شده استفاده گردید. سپس محصول PCR در داخل وکتور pTZ57R/T کلون شده و متعاقبا پلاسمید کلون شده در باکتری E.Coli ترانس فورم شده و به دنبال آن پلاسمید حاوی ژن کامل (pT-ROP2) ROP2 که توسط هضم آنزیمی و PCR تایید شده بود، از باکتریهای ترانس فورم شده، استخراج گردید و از آن برای توالی یابی ژن کامل ROP2 استفاده گردید.یافته ها: این پژوهش نشان داد که ژن کامل ROP2 در داخل پلاسمید pTZ57R/T کلون شده و پلاسمید نوترکیب (pT-ROP2) را تشکیل می دهد. توالی یابی ژن کامل ROP2 که در داخل وکتور pTZ57R/T کلون شده است، نشان دادکه توالی ژن کامل ROP2 از سوش بسیار بیماریزای توکسوپلاسماگوندی (معروف به سوش RH) شباهت زیاد 98 درصدی با سوش RH موجود در بانک ژنی دارد. (Gen bank Accession No.Z36906.1).بحث و نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان داد که با موفقیت ژن کامل ROP2 در داخل پلاسمید pTZ57R/T کلون شده است و از این پلاسمید نوترکیب (pT-ROP2) می توان برای ساختن DNA واکسن بر علیه توکسوپلاسموزیس استفاده کرد.

سابقه و هدف توکسوپلاسما گوندیی انگل تک یاخته درون سلولی اجباری می باشد. با توجه به شیوع بالای توکسوپلاسموزیس و اهمیت وافر این بیماری در بهداشت عمومی، دستیابی به واکسن موثر و روش های تشخیصی حساس برای این بیماری، بیش از پیش حائز اهمیت است. هدف از این بررسی، شناسایی و کلون کردن ژن کدکننده پروتئین ROP13 سویه RH انگل توکسوپلاسما گوندیی و بیان آن در سلول یوکاریوتیک CHO بود. مواد و روش ها در این تحقیق، ژن ROP13پس از تکثیر با روش PCR، در پلاسمید انتقالی pTG19-Tکلون و پس از آن در سوش TOP10 باکتری E. coli ترانسفورم شد. سپس ساب کلونینگ ژن ROP13 در پلاسمید بیانی pcDNA3 انجام شد. هم چنین پلاسمید pcROP13 در سلول یوکاریوتی CHO ترانسفکت شد و به منظور بررسی بیان ژن نوترکیب از روش IFA استفاده شد. یافته ها با استفاده از روش های PCR، تعیین توالی و روش هضم آنزیمی، کلونینگ ژن ROP13 در پلاسمیدهای بیانی و انتقالی تایید شد. نتایج تعیین توالی ژن کدکننده ROP13 با سویه RH ثبت شده در بانک جهانی ژن تشابه کامل داشت. هم چنین با استفاده از روش IFA، بیان ژن ROP13 در سلول یوکاریوتیک CHO مورد تایید قرار گرفت. استنتاج نتایج نشان داد که کلونینگ و ترانسفورم قطعه ROP13 در پلاسمید pcDNA3با موفقیت انجام شده و در سلول یوکاریوتCHO بیان می شود. لذا از این پلاسمید نوترکیب می توان در مطالعات آتی به منظور واکسیناسیون و تشخیص عفونت می توان بهره برد.

هدف: توکسوپلاسموزیس یک بیماری انگلی شایع در سراسر دنیا است که می تواند منجر به عوارض شدید در انسان و حیوان شود. تاکنون انواع مختلفی از DNA واکسن ها که حاوی یک یا چند آنتی ژن این انگل بوده علیه آن مورد آزمایش قرار گرفته است که برخی از آن ها مقاومت نسبی ایجاد نمودند. در این مطالعه DNA واکسن حاوی ژن راپتری پروتئین 1 توکسوپلاسما گوندیی به همراه آلومینیم فسفات و آلوم به عنوان آدجوانت معدنی استفاده شد و تاثیر آن مقایسه شد.مواد و روش ها: گروه های مختلف موش های BALB/c به تنهایی با پلاسمید بیانی حاوی راپتری پروتئین 1 (pcROP1) یا همراه با آلومینیم فسفات و آلوم ایمنی زایی شده و سپس شاخص های ایمنولوژیک شامل تکثیر لنفوسیت های طحالی، سایتوکین ها، آنتی بادی ها و میزان بقا در این موش ها اندازه گیری و مقایسه شد.نتایج: در گروهی که DNA واکسن حاوی راپتری پروتئین 1 توکسوپلاسما همراه با آلوم تجویز شده بود، پاسخ ایمنی هومورال و سلولی (نوع (Th1 قوی تر از گروهی بود که همین DNA واکسن را همراه با آلومینیم فسفات دریافت کرده بود. ولی در گروهی که DNA واکسن حاوی راپتری پروتئین 1 توکسوپلاسما به تنهایی تجویز شده بود، پاسخ های ایمنی از هر دو گروه مذکور بالاتر بود.بعد از چالش موش ها، میزان بقا در گروه هایی که DNA واکسن مذکور را همراه با آلوم یا به تنهایی دریافت نموده بودند به طور معنی دار افزایش یافت ولی میزان بقا در گروهی که همین DNA واکسن را همراه با آلومینیم فسفات دریافت نموده بود، افزایش چشمگیری نشان نداد (P£0.05).نتیجه گیری: نتایج بررسی حاضر نشان داد که آلوم و آلومینیم فسفات توانایی بالقوه برای افزایش تاثیر DNA واکسن حاوی ژن راپتری پروتئین 1 توکسوپلاسما گونده ای را ندارد.

هدف: توکسوپلاسما گوندی یک انگل تک یاخته ای داخل سلولی است که موجب بیماری توکسوپلاسموزیز در انسان و حیوان می شود. در سال های اخیر پیشرفت چشمگیری در زمینه شناخت کاندیدهای مناسب واکسن که باعث القای پاسخ های ایمنی موثر می شود، صورت گرفته است.در این مطالعه، از ژن کامل راپتری -2 توکسوپلاسما گوندی برای ساخت DNA واکسن استفاده شد و در نهایت پاسخ های ایمنی ناشی از این ژن در مقایسه با گروه های کنترل ارزیابی شد.مواد و روش ها: ایمنی زایی موش های BALB/c سه بار و به صورت عضلانی (به فاصله سه هفته) توسط  pc-ROP2 (به عنوان گروه شاهد) و pc DNA3 و فسفات بافر سالین (به عنوان گروه های کنترل) انجام پذیرفت.بعد از انجام ایمونیزاسیون، پاسخ های ایمنی ناشی از آن به کمک اندازه گیری سطح آنتی بادی و سطح سیتوکین ها ارزیابی شد.نتایج: نتایج حاصل از اندازه گیری سیتوکین های اینترفرون گاما و اینترلوکین 4 نشان دهنده مقادیر بالای اینترفرون گاما و مقادیر پایین اینترلوکین 4 در گروه های واکسینه شده با pc-ROP2 در مقایسه با گروه های کنترل بود. ایطن نتایج نشان می دهد که پاسخ ایمنی سلولی Th1 در موش هایی که با pc-ROP2 واکسینه شده اند در مقایسه با موش های گروه های کنترل که با پلاسمید خالی pc-DNA3 و فسفات بافر سالین واکسینه شده اند، به شدت تحریک شده است.اندازه گیری آنتی بادی کل IgG اختلاف معنی دار را بین گروه های مورد و کنترل تایید کرد همچنین میزان بقای موش ها در گروه های مورد و کنترل بعد از انجام چالش ارزیابی شد. نتایج به دست آمده نشان داد که میزان بقای موش هایی که با پلاسمید pc-ROP2 ایمن سازی شدند، با گروه های کنترل اختلاف معنی دار دارند (P<0.05).نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان می دهد که pc-ROP2 به عنوان DNA واکسن در القای پاسخ های ایمنی همورال و سلولی مؤثر بوده و همچنین در افزایش طول عمر موش ها در برابر توکسوپلاسموزیز تا اندازه ای مفید است.

امروزه مشکلاتی که جذب ساکارز برای سلامتی افراد به وجودآورده، تقاضا برای شیرین کننده های طبیعی دارای مزه مطلوب تر و جذب کمتر ازجمله پروتئین های شیرین را افزایش داده است. در میان آنها برازئین به واسطه شیرینی قوی، منشاء طبیعی و پایداری مطلوب جایگزینی مناسب برای ساکارز محسوب می شود. برازئین از میوه گیاه آفریقایی Pentadiplandra brazzeana Baillon که تولید تجاری آن در مقیاس بالا غیرعملی است، جدا شده است. بنابراین تولید تجاری وسیع این پروتئین نیازمند بیان آن در یک سیستم هترولوگوس ازطریق تکنولوژی DNA نوترکیب است. در این پژوهش باتوجه به در دسترس نبودن ژنوم گیاه P. brazzeana سنتز مصنوعی ژن برازئین با استفاده از تکنیک های Assembly PCR و SOEing PCR انجام شد. ابتدا توالی اسیدآمینه ای پروتئین برازئین با سرور Emboss Backtranseq بر اساس کدون های ترجیحی ذرت به توالی 162 نوکلئوتیدی ترجمه شد. سپس با استفاده از 6 آغازگر هم پوشان طی 5 واکنش متوالی PCR توالی کامل ژن برازئین سنتز شد. نتایج حاصل از واکنش PCR صحت کار را نشان داد. سپس قطعه حاصله در وکتورهای بیانی گیاهی pBI121 با پیشبر عمومی CaMV35S و پیشبر اختصاصی بذر Napin کلون شد و نتایج تعیین توالی صحت قطعه سنتزی کلون شده را تایید کرد.

ژن LTP کد کننده پروتئین ناقل لیپید در گیاهان می باشد. این ژن غنی از بازهای گوانین و سیتوزین می باشد. وجود این بازها باعث می شود تا آغازگرهای طراحی شده برای ژن LTP در مرحله اتصال در چرخهPCR ، ساختارهای ثانویه زیادی ایجاد کنند و نهایتا محصول غیر اختصاصی تولید شود. موادی مثل بتائین، دی متیل سولفوکسید (DMSO) و آمونیوم سولفات (AMS) می توانند این مانع را رفع کنند. در این تحقیق گرادیانی از هر یک از این مواد در واکنش PCR گذاشته شد و نهایتا غلظت های بهینه برای هر کدام از این مواد به دست آمد. در این میان 4.5 میکرولیتر بتائین 5M))، 2.25 میکرولیتر دی متیل سولفوکسید (10%) و 2.25 میکرولیتر بافر آمونیوم سولفات در حجم کلی 25 میکرولیتر از مخلوطPCR ، غلظت های بهینه گزارش شدند.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.